乱れたタンパク質、p27Kip1 を阻害する低分子の発見

Scientific Reports volume 5、記事番号: 15686 (2015) この記事を引用

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無秩序なタンパク質は生体系で非常に蔓延しており、それらは無数のシグナル伝達および制御プロセスを制御しており、そのレベルおよび/または細胞局在はヒトの疾患において変化することがよくあります。 折りたたまれたタンパク質とは対照的に、構造の不均一性と動態により、無秩序なタンパク質は、実行可能な薬剤標的とはみなされません。 私たちは、NMR ベースのスクリーニングを通じて、無秩序な細胞周期制御因子である p27Kip1 (p27) に弱いとはいえ特異的に結合する小分子を同定することで、このパラダイムに挑戦しました。 2 つの分子グループは、p27 内の芳香族残基の一時的なクラスターによって作成された部位に結合します。 これら 2 つの小分子グループ内の保存された化学的特徴は、p27 内のそれらの結合部位に対する相補性を示し、小分子:無秩序なタンパク質相互作用の構造活性関係を確立しました。 最後に、1 つの化合物が in vitro で p27 の Cdk2/サイクリン A 阻害機能に対抗し、小分子がフォールディングおよび天然構造への結合が不可能な立体構造での隔離を通じて無秩序なタンパク質 (p27) の機能を阻害できるという原理の証明を提供しました。制御ターゲット (Cdk2/サイクリン A)。

本質的に無秩序なタンパク質 (IDP) は真核細胞に広く普及しており、多くの場合、調節機能やシグナル伝達機能を果たします 1。 構造クラスとして、IDP は酵母からヒトに至るまでの折りたたまれたタンパク質よりも厳密に制御されており 2、過剰発現すると、折りたたまれた対応物よりも細胞の表現型を変化させる傾向があります 3。 したがって、正常な乱れたタンパク質の恒常性を維持することは、細胞の挙動にとって重要です。 折りたたまれたドメインを持つタンパク質の過剰発現または活性亢進に関連する表現型は、例えば酵素機能（例、慢性骨髄性白血病におけるBCR-Ablを阻害するグリベック4）またはタンパク質間相互作用（例、ABT- 263 および ABT-199 は、血液およびリンパ系悪性腫瘍において BCL-2 および BCL-xL を阻害します 5,6)。 対照的に、無秩序なタンパク質は、その動的かつ不均一な立体構造のため、小分子による阻害の標的となることが困難です。 それにもかかわらず、進歩は見られました。 例えば、糖尿病、肥満、乳がんにおける役割が知られているホスファターゼPTP1Bの阻害剤（MSI-1436）は、構造的、生化学的、機能的アッセイを通じて、ホスファターゼPTP1Bの無秩序な調節領域に結合することによりアロステリック機構を通じて作用することが最近示された。酵素7. また、ユーイング肉腫ファミリー腫瘍に関連する障害のあるEWS-FLI1融合腫瘍タンパク質に結合する小分子（YK-4-279）は、腫瘍細胞におけるEWS-FLI1の機能的パートナーであるRNAヘリカーゼA（RHA）8への直接結合を阻害した8。そして、RHA依存性のタンパク質相互作用とRNAスプライシングが変化しました9。 これらの化合物 (MSI-1436 および YK-4-279) は両方とも、細胞アッセイでオンターゲット効果を示しました 8,9。 他の研究では、無秩序な cMyc10、11、12、α-シヌクレイン 13、およびアルツハイマー β-アミロイド ペプチド 14 を標的とする小分子が同定されています。 最近の計算機研究 15 では、cMyc 機能を調節することが以前に報告されている小分子 (10074-A4) 10 が、多くの乱れた立体構造の集合体内で異なる cMyc 分子に異なる方法で結合していることが示され、著者らは「タンパク質に結合するリガンドクラウド」という概念を提案するに至った雲」。 上で論じた研究では、機能的スクリーニング、インビトロ結合スクリーニングおよび／または計算スクリーニングを含む様々なアプローチを使用して、無秩序なタンパク質を標的とする小分子が発見された。 折りたたまれたタンパク質標的に結合するフラグメントと呼ばれる低分子量小分子（16 で概説）の核磁気共鳴（NMR）ベースのスクリーニングは、創薬プロセスにおける最初の「ヒット」を特定するための十分に確立された方法です17、18。 しかし、我々の知る限り、NMR ベースのフラグメント スクリーニングは、無秩序なタンパク質標的に結合する小分子の同定には適用されていません。 今回我々は、NMR ベースのスクリーニングを利用して、真核生物の細胞分裂を制御するサイクリン依存性キナーゼの制御因子である、典型的な無秩序タンパク質 p27Kip1 (p27; CDKN1B としても知られる) に結合し、その機能を調節するフラグメント分子を同定しました 19。

p27 を標的とした動機は 2 つあります。 第一に、p27 の構造的および機能的特徴はよく理解されており 20、21、22、23、小分子と無秩序なタンパク質の相互作用を研究するための理想的なモデル系を提供します。 第二に、p27 機能を化学的に調節できる能力は、いくつかの生物学的環境において有益であると考えられます。 例えば、乳がんでは p27 のスレオニン 157 が不適切にリン酸化されており、これは異常な細胞質局在化および細胞遊走の上方制御に関連しています 24、25、26、27。 p27 の小分子阻害剤が利用できれば、乳がん細胞の異常な移動を防ぐのに有益と考えられます。 あるいは、内耳の感覚上皮細胞と非感覚上皮細胞の両方において、p27 は細胞周期の出口と最終分化を維持し 28、その阻害により細胞周期の再突入と聴力回復のための再生がもたらされます 29,30。 p27 の転写を阻害する小分子は報告されているが 31、我々はここで、p27 に直接結合し、上で議論した 2 つの細胞環境においてその機能を変化させる可能性のある小分子を同定するアプローチを開発した。

私たちの研究の標的は、p27 の N 末端キナーゼ阻害ドメイン (p27-KID) でした。このドメインは、真核生物の細胞分裂を制御する核サイクリン依存性キナーゼ (Cdk)/サイクリン複合体に結合して、その触媒活性を制御します 32。 p27-KID は、単独では高度に無秩序である 20,21 が、Cdk2/サイクリン A に結合すると拡張構造をとり（図 1a）、機能的に異なる 3 つのサブドメインに細分化できます。 サブドメイン D1 はサイクリン A 上の保存されたポケットに結合し、基質の動員をブロックします 33。 サブドメイン D2 は、Cdk2 に結合すると分子内および分子間 (p27 と Cdk2 の間) の β ストランドを形成し、またその ATP 結合ポケットに 1 回転のヘリックスを挿入してキナーゼ活性を阻害します 34。 サブドメイン LH はサブドメイン D1 と D2 を接続するαヘリックスを形成します。 我々は、p27-KIDに結合する小分子が同定できれば、それらが無秩序なポリペプチドを誘導して、Cdk/サイクリン複合体に結合できない構造をとる可能性があると仮説を立てた。 我々は、NMR 分光法を使用して p27-KID への結合についてフラグメント分子のライブラリーをスクリーニングすることにより、この仮説を検証しました。 我々は、p27-KID の 2 つの部分的に重複した領域に弱いが特異的に特異的に結合するフラグメント分子の 2 つのサブセット (合計 36) を同定しました。 これらのサブセットから、p27-KID に結合する追加の小分子の同定と構造活性関係のさらなる解明を可能にするファーマコフォア モデルを生成しました。 蛍光異方性、NMR分光法、Cdk2キナーゼ活性アッセイなどのさまざまなアッセイを用いて、同定された小分子の1つがp27のキナーゼ結合領域をCdk2から置き換え、Cdk2の触媒活性を部分的に回復したことを実証した。 さらに、分子動力学計算により、小分子が標的とする p27 領域の動的な「構造」についての洞察が得られました。 私たちの結果は、小分子と無秩序なタンパク質の間の相互作用の性質についての洞察を提供し、そのような相互作用が無秩序なタンパク質の調節機能を変化させる可能性があることを実証しています。

無秩序な p27-KID の異なるが重複する領域に特異的に結合する 2 つのグループの小分子の同定。

(a) Cdk2/サイクリン A に結合した p27-KID の構造 (PDB ID 1JSU)。 D1、LH、D2.1、D2.2、およびD2.3を含むp27-KIDのサブドメインが示されています。 (b、c) p27-KID に結合し、それぞれグループ 1 とグループ 2 のメンバーである 2 つの小分子、SJ572710 (SJ710) (b) および SJ572403 (SJ403) (c) の化学構造 (グループの本文を参照)定義）。 （d、e）それぞれ（b）および（c）の化合物の15N-p27-への滴定からの個々の1H化学シフト摂動値（2D 1H-15N「同相」HSQCスペクトルの分析による）を示すヒストグラム。子供。 p27-KID残基との特異的相互作用を特定するための閾値は、摂動値の平均を2標準偏差上回るものとして定義されました(グラフの黒い点線で表示)。 1H 次元 (2.4 Hz) の実験的なスペクトル分解能は、マゼンタの点線で表されます。 １５Ｎ－ｐ２７－ＫＩＤ（１００μＭ）対阻害剤のモル比１：３０の場合の化学シフト摂動が示されている。 (f、g) SJ710 (f) および SJ403 (g) の濃度に対してプロットされたアミドプロトンの化学シフト摂動。 選択した残基の結合等温線は、p27-KID とフラグメント ヒット間の特異的結合を示します。 化学シフトの軌跡 (黒い実線) は、p27-KID と SJ710 (f) および SJ403 (g) との相互作用について、それぞれ 4.8 ± 1.3 および 2.2 ± 0.3 mM の全体的な解離定数を報告します。

我々は、一次元 (1D) 1H WaterLOGSY35 および STD36 NMR 法を使用して、p27-KID に結合する「フラグメント様」小分子 37、38、39 を同定しました。 フラグメント分子は、市販のライブラリー (Ro3 コレクション、Maybridge/Thermo Fisher Scientific の 1,100 化合物) または「Rule of Three」40 およびその他の基準に基づいて 1,222 化合物の社内ライブラリーから選択されました (「方法」を参照)。 それぞれのライブラリから、p27-KIDに結合する2分子と7分子が同定されました（「ヒット」と呼ばれます。代表的な1D 1H NMRデータは付録の図1a、bに示されており、すべての予備ヒットは付録の表1aに示されています）。 これらの化合物の結合部位は、15N-p27-KID への滴定および二次元 (2D) 1H-15N HSQC スペクトルの分析によって同定されました。 重大な化学シフト摂動 (CSP) は、アミド 1H 共鳴 (方法を参照) で最大でしたが、p27-KID (p27-D2) の D2 サブドメイン内の残基のアミド基でのみ観察されました。 8 つのヒットにより、サブ領域 D2.3 と呼ばれる配列 F87YY89 [(F、フェニルアラニン; および Y、チロシン) を持つ短い領域内で CSP が発生しました。 図1a、d]と1つのヒットにより、同じ領域内および残基W60N61およびE75WQ77[(W、トリプトファン、N、アスパラギン、E、グルタミン酸、およびQ、グルタミン)の近くの他の2つの領域内にCSPが発生しました。サブと呼ばれます- それぞれドメイン D2.1 および D2.2; 図1a、e]。 これらの分子をそれぞれグループ 1 およびグループ 2 と名付けました (図 1b、c)。 代表的な 1H CSP ヒストグラムを図 1d、e に示し、15N CSP を付録に示します。 図 2. 他のすべての小分子のデータは、付録に示されています。 図3

コンピュータモデリングを使用してグループ 1 およびグループ 2 の分子を分析し、元の 1D NMR スクリーニングでは検出されなかった 2 つのフラグメント ライブラリ内の追加の候補 p27-KID 結合分子を同定しました。 これらの分子の 1D および 2D NMR 分析により、さらに 15 種類の p27-D2 結合化合物が同定されました (6 種類はグループ 1 のような結合特徴を持ち、9 つはグループ 2 のような特徴を持ちます。補足図 3b および補足表 1b)。 。 CSP は高化合物濃度で観察され、p27-D2 への結合が比較的弱いことと一致していましたが、p27-D2 内の注目領域に特異的であり、厳密に再現可能でした。 グループ 1 (SJ572710、以下 SJ710 と呼びます) およびグループ 2 (SJ572403、以下 SJ403 と呼びます) の 16 点 2D 1H-15N 「同相」HSQC NMR 滴定は、それぞれ一定濃度の 15N-p27-KID (100 μM)、p27-KID の特異的共鳴に対する解釈可能な結合等温線を提供しました。 決定された解離定数（Kd）値は、それぞれ4.8±1.3および2.2±0.3mMでした（図1f、g）。 2D 1H-15N HSQC NMR スペクトルを重ねて図 2 に示します。

フラグメント ヒットは、p27-KID の D2 サブドメイン内の特定の領域との特異的な相互作用を示します。

フラグメントヒットSJ710 (a、グループ1)およびSJ403 (d、グループ2)の滴定後の、p27-KIDのD2サブドメイン内の特定の残基の化学シフト摂動を示す、2D 1H-15N「同相」HSQC NMRスペクトルの重ね合わせ。 各ヒットについて、合計 16 のスペクトルが記録されました。 15N-p27-KID (100 μM) の濃度は滴定全体を通じて一定に維持され、阻害剤の濃度は 0 (赤) から 3 mM (青) まで変化しました。 すべての実験は 800 MHz 分光計で実行され、1H 次元と 15N 次元でそれぞれ 2.4 Hz と 1.7 Hz のスペクトル分解能を提供する取得パラメータを利用しました。 左下の挿入図は、トリプトファン インドール NH 部分 (s-W60、s-W76) の共鳴を示しています。 （b、e）それぞれSJ710（b）およびSJ403（e）との相互作用に関与するp27-KID残基のサブセットを示す拡大領域（青いボックス）。 （c、f）それぞれSJ710（c）およびSJ403（f）との相互作用時に摂動を示さない2つのp27-KID残基を示す拡大領域（ブラックボックス）。

三次元（3D）分子相互作用場分析41（「方法」セクションを参照）により、p27-D2結合分子の2つのグループの共通の化学的特徴が特定されました（図3a、b）。 この分析により、静電相互作用、ファンデルワールス相互作用、および疎水性相互作用に有利に関与できる小分子の周囲の相互作用「場点」が明らかになりました。 これらのフィールドポイントは、分子の類似性を計算し、異なる二次元トポロジーを持つ分子であっても分子を整列させて共通のファーマコフォアを定義するために使用されます。

p27-KID に結合した 2 つの小分子グループのコンセンサス フィールド マップ。

青と赤のフィールド ポイントは、タンパク質結合パートナーにおいてそれぞれ陽性基と電気陰性基が優先される場所を示します。 金色のフィールドポイントは、疎水性相互作用が好まれる領域を示します。 黄色のフィールド点は、有利なファンデルワールス接触が可能な領域を示します。 フィールドポイントのサイズは、有利な相互作用エネルギーの大きさに応じて増加します。 グループ 1 (a) およびグループ 2 (b) の 2 つの代表的な分子が、それぞれのコンセンサス フィールド マップに合わせて示されています。

グループ 1 とグループ 2 の分子は 2 つまたは 3 つの複素芳香環を持っていますが、有利な磁場点の分布が大きく異なります。 グループ1は主に、大きな疎水性コア（近接した複数の金色のポリゴン、図3a）、1つの大きな陽性相互作用領域（近接した2つのシアンのポリゴン）、および2つの小さな陽性（シアン）および電気陰性（赤色）フィールドポイントによって定義されます。疎水性コアの反対側の端にあります。 対照的に、グループ2のフィールドマップ（図3b）は、グループ1と比較してより小さな疎水性コアと、有利な電気陽性相互作用の2つの同じサイズの領域を示しました。 化学スクリーニングの多様性を拡張するために、グループ 1 および 2 分子のコンセンサス フィールド マップを使用して、10,455 個の市販のフラグメント様分子のライブラリー内でさらに 184 個の可能性のある p27-D2 結合分子を同定しました。 これらの 1D および 2D NMR 分析により、さらに 12 個の p27-D2 結合化合物が同定されました (グループ 1 のような結合特徴を持つ 8 つおよびグループ 2 のような特徴を持つ 4 つ; 補足図 3c および補足表 1c)。 これらの追加の分子は、以前に同定されたヒットと同等の CSP プロファイルを持っていました。 小分子と無秩序なタンパク質の相互作用の特異性をさらにテストするために、単純なアミノ酸であるトリプトファンとチロシンが p27-KID に結合するかどうかを決定しました。 しかし、30倍モル過剰に滴定した場合でも、どちらの芳香族アミノ酸も、p27-KIDへの滴定時に2D HSQCスペクトルに化学シフトの乱れを引き起こしません(補足図4)。 これは、フラグメント ヒットの 2 つのグループのファーマコフォア モデルに具体化されている特定の化学的特徴が欠けているためであると考えられます。

我々は、グループ 2 分子である SJ403 (補足表 1b) を使用して、p27 に結合する分子がその Cdk 調節機能を変化させる可能性があるという仮説を検証しました。 これらの実験では、SJ403はp27-KIDに弱く結合するため、Cdk2/サイクリンAへのp27-D2の結合を調節するSJ403の能力を研究しました（Cdk2/サイクリンAへの結合Kd値、73±8nM;図4a対5） p27-KID20の場合はnM）。 まず、蛍光異方性 (FA) を使用して、アルギニン 93 が Cys (R93C) に変異し、Alexa Fluor 488 (p27-D2-FL) で標識された p27-D2 の単一システイン (Cys) 変異体の Cdk2 からの置換をモニタリングしました。 SJ403による/サイクリンA。 SJ403の滴定により、p27-D2-FLのFAが濃度依存的に減少し、IC50値が475±67μMとなり（図4b）、SJ403がp27-D2をCdk2 /サイクリンAから置き換えたことを示唆しています。

SJ403によるCdk2/サイクリンAからのp27-D2-FLの置換の蛍光異方性分析。

(a) p27-D2-FL に結合する Cdk2/サイクリン A の蛍光異方性分析。 p27機能に対するフラグメントヒットSJ403の効果を評価するための開始条件(20nM p27-D2-FL、300nM Cdk2/サイクリンA)は、結合等温線上の赤い円として表されます。 (b) SJ403 の滴定 (0 ～ 3 mM) により、p27-D2 が Cdk2/サイクリン A から置換され、その結果、蛍光異方性値が減少しました。 実験は３回行い、平均値と平均値の標準偏差を示した。

次に、NMR 分光法を使用して、SJ403 による Cdk2/サイクリン A からの 2H/13C/15N 標識 p27-D2 の置換をモニタリングしました。 p27-D2とCdk2/サイクリンA(100μM)の複合体は、わずかに過剰の2H/13C/15N-p27-D2(モル比、1.1:1.0 p27-D2:Cdk2/サイクリンA)を用いて調製した。 未結合の p27-D2 のピークは SJ403 の存在下で強度が劇的に増加しましたが、Cdk2/サイクリン A に結合した p27-D2 の共鳴の強度は減少しました (図 5 および補足図 7a ～ c​​)。レシオメトリック法を使用して、2D TROSY-HSQC NMR スペクトルを分析しました。 この方法では、遊離状態の共鳴の相対集団 (pf; 各 p27-D2 残基の共鳴について) は、特定の残基に対する遊離共鳴と結合共鳴の両方の合計強度の割合として決定されました。 これらの値は、2 つの相対的な遊離状態集団の比率 (pfw/SJ403/pfw/o SJ403) を形成することによって比較されました。 1 より大きい値は、化合物に依存する変位を示します。 結合状態の相対集団 (pb) も、SJ403 を含まないサンプル (pbw/o SJ403) と SJ403 を含むサンプル (pbw/SJ403) について決定されました。 この場合、1未満の比は、Cdk2 /サイクリンAからのp27-D2の置換を示しました。さらに、遊離状態の共鳴の化学シフト値は、SJ403へのp27-D2の結合を反映しました（補足図7d、e）。これは、SJ403 が p27-D2 と Cdk2/サイクリン A の間の結合平衡をシフトさせ、タンパク質:小分子相互作用を通じて未結合の p27-D2 の数を増加させるという結論を裏付けています。

SJ403によるCdk2/サイクリンAからの15N-p27-D2の置換の2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR分析。

SJ403 (3 mM) の非存在下 (対照) および存在下での p27-D2/Cdk2/サイクリン A の 2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR スペクトルをそれぞれ記録しました。 報告された残基については、遊離および結合 p27-D2 共鳴の両方が TROSY-HSQC スペクトルで観察されました。 SJ403 存在下での p27-D2/Cdk2/サイクリン A の TROSY-HSQC スペクトルでは、対照スペクトル (a) と比較して、遊離 p27-D2 共鳴の相対強度の増加が観察されましたが、p27 の共鳴はCdk2/サイクリン A に結合した -D2 は相対強度の減少を示しました (b)。 これにより、SJ403の非存在下(SJ403なし)およびSJ403の存在下(SJ403あり)における、遊離(f)および結合(b)p27-D2の集団の計算が可能になります。 pfw/o SJ403 値は、SJ403 添加前の遊離状態の p27-D2 の共鳴の相対集団を表し、pfw/SJ403 値は、SJ403 添加後の遊離状態の p27-D2 共鳴の相対集団を表します。 対応して、pbw/o SJ403 値は、SJ403 添加前の Cdk2/サイクリン A に結合した p27-D2 の共鳴の相対集団を表し、pbw/SJ403 値は、SJ403 添加後の結合状態の p27-D2 共鳴の相対集団を表します。 3 回の測定の平均値と平均値の標準偏差が表示されます。 三重の 2D 1H-15N TROSY-HSQC スペクトルの 1 セットは、付録に示されています。 図7。

FA および NMR の結果は、SJ403 が Cdk2/サイクリン A から p27-D2 を部分的に置換したことを示しました。 したがって、我々は次に、置換がCdk2のキナーゼ活性を調節するかどうかを調査した。 p27-D2は、p27-KIDに見られるD1およびLHサブドメインを欠いているが、依然として中程度に強力なCdk2/サイクリンA阻害剤である(IC50値、152±39nM;補足図9a)。 Cdk2/サイクリン A が p27-D2 によってほぼ完全に阻害された (完全なキナーゼ活性の約 13% が維持された) 条件下では、FA および NMR 実験で示された濃度範囲にわたって SJ403 を滴定して p27-D2 置換を引き起こすと、キナーゼが増加しました。活性（13％から約20％へ、>50％増加；図6aおよび補足図9b）は、SJ403によるCdk2/サイクリンAからのp27-D2の部分的置換と一致する。 さらに、p27-D2の非存在下では、SJ403は、p27-D2の存在下ではp27-D2置換およびキナーゼ活性の増加に関連する濃度でCdk2/サイクリンA活性を実質的に阻害した（図6bおよび補足9c）。 。 したがって、SJ403の二次効果はキナーゼを阻害するとしても、SJ403の主な効果はCdk2/サイクリンAからのp27-D2の置換(SJ403のp27-D2への結合による)とキナーゼ活性の部分的な回復であると結論付けます。活性（SJ403のCdk2/サイクリンAへの結合による）。 これらの結果は、小分子 (SJ403) が、Cdk2/サイクリン A に結合して阻害できない構造での隔離を介して、無秩序なタンパク質 (p27-D2) の機能を阻害するという原理の証明を提供します。

小分子 SJ403 は、Cdk2/サイクリン A から p27-D2 を置き換え、Cdk2 キナーゼ活性を部分的に回復します。

p27-D2 (200 nM) およびさまざまな濃度の SJ403 (10 μM ～ 3 mM) の存在下での Cdk2 キナーゼ活性の分析 [基質としてヒストン H1 を使用した Cdk2/サイクリン A 複合体 (200 pM) 内] (a ）およびさまざまな濃度の SJ403 単独（b）。 CDk2 は (a) の開始条件下で部分的に活性ですが、SJ403 の添加により活性が強化されます。 p27-D2 が存在しない場合 (b)、SJ403 の添加は Cdk2 阻害と関連します。 すべての実験は 3 回実行され、平均値と平均値の標準偏差が示されています。

我々は以前、NMRおよび分子動力学（MD）計算データに基づいて、p27-KIDが、LHサブドメイン内のらせん構造、サブ領域内のβヘアピン構造など、遊離状態でさまざまなタイプの部分的に存在する二次構造を示すことを示しました。 Ｄ２．１およびサブドメインＤ２のサブ領域Ｄ２．３内の螺旋構造（参考文献２１；サブドメイン／サブ領域の命名法については図１ａを参照）。 興味深いことに、グループ 1 およびグループ 2 の分子は、p27-KID の部分的に構造化された領域のうちの 2 つ (サブ領域 D2.1 および D2.3) と可変的に相互作用しましたが、非常に動的で相互作用するサブ領域 D2.2 とも相互作用しました。持続的な二次構造を示さない 21 (図 7a-c)。 これらの相互作用部位はすべて Cdk2 結合 D2 サブドメイン内にあります。 注目すべきことに、p27結合分子はサブドメインD1またはLHと相互作用しなかった。 重要なことに、小分子と相互作用するp27-KID内の各領域には、いくつかの芳香族アミノ酸が含まれていました（図7a）。 実際、サブドメイン D2 には、p27 内に見られる 9 つの芳香族アミノ酸のうち 8 つが含まれています。 9番目のF33はサブドメインD1内に見られますが、小分子に結合しました。 グループ 1 分子は、サブ領域 D2.3 内の残基 F87、Y88、および Y89 に対して最大の CSP を引き起こし、グループ 2 分子は、これらの残基、ならびに残基 W60、N61 (サブ領域 D2.1) および E75、W76 に対して共鳴を摂動させました。および Q77 (サブ領域 D2.2)。 フェニルアラニン (F) またはチロシン (Y) 残基はトリプトファン (W) 残基に隣接していますが、グループ 2 化合物の存在下では W 残基よりも小さな CSP 値を示し、小分子がインドール環の電子環境を優先的に乱すことを示唆しています。これらの残留物の。 我々は、p27-KID 内の W60 または W76、またはその両方を F またはアラニン (A) に突然変異誘発することによってこの仮説を検証し、2D NMR を使用して SJ403 への結合をマッピングしました。 単一変異体p27-KIDバリアントは、変異W残基付近の摂動が存在しないことを除いて、野生型p27-KIDで観察されたものと同様のCSPパターンを示しました（補足図5a、b、d、e）。 ただし、2つの二重変異p27-KIDバリアントは、F87YY89芳香族クラスター内で非常に弱いCSPのみを示しました（補足図5c、f）。 まとめると、これらの結果は、2 つの W 残基、W60 および W76 のそれぞれが SJ403 への結合に実質的に寄与していることを示しました。 F87、Y88、または Y89 から A への変異は、p27-KID のグループ 1 化合物結合領域内の CSP の大幅な減少と関連していましたが (補足図 5j-l)、R90 から A への変異 (補足図 5m) は、結合にはほとんど影響がなく、芳香族側鎖のクラスター化が小分子とタンパク質の相互作用に重要であることを示唆しています。 Y88からAへのp27-KID変異体では、グループ2の化合物SJ403は2つのW残基(W60またはW76)付近でCSPを引き起こしたが、p27-KIDのF87A88Y89領域内ではCSPを引き起こさなかった(補足図5h)。 ただし、F87からAおよびY89からAへの変異体では、SJ403は野生型p27-KIDで観察されたものと同様のCSPパターンを引き起こし（補足図5g、i）、Y88がSJ403との相互作用に大きく寄与していることを示唆しています(そしておそらく他のグループ 2 化合物) Y89 よりも。

小分子は、p27-KID の D2 サブドメインを持つ芳香族残基のクラスターに結合します。

(a) サブドメイン D2 および個々の小分子結合領域 (D2.1、D2.2、および D2.3 と標識) を示す p27-D2 のアミノ酸配列。 これらの領域内の芳香族アミノ酸は太字で示されています。 これらは、p27-KID 内の 9 つの芳香族残基のうちの 8 つを表します。 (b、c) すべてのグループ 1 (b) およびグループ 2 (c) 化合物の 1H 化学シフト摂動値の平均。それぞれ、Y (b)、W および Y (c) 残基との相互作用の優先性を示します。

p27の2つのW残基とY88は、関連する無秩序な細胞周期調節タンパク質であるp21Waf1/Cip1 42（p21;図8a）に保存されており、グループ1および2の化合物との相互作用におけるそれらの優位性をさらにテストすることができます（図8b） 、c）。 グループ2の化合物SJ403は、p21のW49およびW65付近の残基（p21キナーゼ阻害ドメイン、p21-KID内）と相互作用しましたが、Y77（p27のY88と相同；図8c）とは相互作用せず、W残基の重要性を裏付けています。この小分子との相互作用だけでなく、追加の相互作用には少なくとも 2 つの Y 残基と F 残基のクラスター化が必要であることも示唆しています。 p21 の Y77 に隣接する 2 つのロイシン (L) 残基 (L76 および L78) は、p27 の F87 および Y89 を置換しません。 同様に、p21のL76YL78領域は、グループ1の化合物への結合をサポートしません(SJ319843;図8b)。 p21-KID に関するこれらの発見は、グループ 1 およびグループ 2 の化合物と p27 の相互作用の分子基盤の説明をさらに強化します。

p21-KID と代表的な p27 フラグメント ヒットとの相互作用。

(a) p27-KID と p21-KID の D2 サブドメインのアミノ酸配列の比較。 (b、c) SJ319843 (b、グループ 1) および SJ403 (c、グループ 2) をそれぞれ 2H/ 15N-p21-KID (20μM)。 p27-KID 残基との特異的結合相互作用を特定するための閾値は、化学シフトの摂動 (Δδave+2σ、黒い点線で表示) の平均を上回る 2 標準偏差として定義され、摂動が実験の 1H デジタル分解能より大きいかどうかを考慮しました。 (マゼンタの点線で示されています)。

p27 内の小分子結合部位の構造的特徴についての洞察を得るために、p27-D2 を使用して分子動力学 (MD) シミュレーション (400 ns 以上) を実行しました。 結果は、より長い p27-KID 構築物に関する過去の MD 所見 (100 ns 以上) を再現しており 21、残基 W60-F64 および H67-L70 (サブ領域 D2.1 内) を含む一時的な β-ヘアピンと、それに含まれる 2 つの α-ヘリックス ターンが明らかになりました。残基E80〜G82およびF87〜Y89（サブ領域D2.3内）。 新しい MD 軌道では、これらの二次構造はナノ秒の短い時間スケールでは安定していましたが、この実験でサンプリングされたより長い期間にわたって展開および再折りたたみが行われました。 これらのより長いタイムスケールの遷移は、サブ領域D2.1および2.2（W60およびW76を含む）およびサブ領域D2.3（Y88を含む、図9a）内の残基を含む疎水性クラスターの一時的な形成と結びついて、拡張されたコンパクトな立体構造（図9bでEおよびCとラベル付けされている）。 代表的な拡張配座異性体とコンパクト配座異性体をそれぞれ図 9c と d に示し、他のすべての配座異性体は付録に示します。 図10a、b。 (小分子への結合に重要な p27 の 3 つの芳香族残基のうちの 2 つ、W60、W76、および Y88 の間隔が 20 Å 未満である場合、配座異性体はコンパクトであると定義されることに注意してください。) 拡張されたコンパクトな立体配座が結合を生み出すと我々は推測しています。それぞれグループ 1 およびグループ 2 の化合物のサイト。 これらの結果についての我々の解釈は、グループ 1 の化合物は、Y88 が W60 および W76 (>20 Å) から遠く離れている p27-D2 分子のサブ領域 D2.3 内の F87YY89 モチーフに結合し、グループ 2 の化合物がコンパクトに結合するというものです。異なるサブ領域 (サブドメイン D2.1、D2.2、および D2.3) 内の 3 つの重要な芳香族残基のうちの少なくとも 2 つがクラスター化されている場合の立体構造。 興味深いことに、MD軌道の分析により、Y88とW60またはW76のいずれかが頻繁に密接に接触しているが、3つの残基すべてが密接に近接していることはほとんどないことが示されました（補足図10c）。 これは、グループ 2 の化合物に結合できるクラスター芳香族残基 (特に Y88 と W60 または W76) を含むいくつかの異なる立体配座が存在することを示唆しており、W60 または W76 のいずれかがグループ 2 に不可欠ではないことを示す突然変異誘発結果と一致しています。 2 化合物の結合 (補足図 5a ～ f)。 要約すると、p27-D2 の新しい MD 結果は、芳香族残基のクラスターを生成および破壊する一時的な構造変動が、グループ 1 およびグループ 2 の小分子の p27-D2 への結合を調節することを強く示唆しています。 これらの結果は、化合物結合の主要な部位としてのＮＭＲによるＷ６０、Ｗ７６およびＹ８８の同定、およびこれらの残基の突然変異によって結合が変化することを示す結果と一致する。

MD シミュレーションから時間の関数としてモニターされた W60、W76、および Y88 Cβ 原子の距離プロファイルは、p27-D2 立体構造アンサンブルにおける拡張されたコンパクトな状態を明らかにします。

(a) MD から経時的にモニターされた Cβ 原子間の距離 (左)、W60-Y88 (中央)、および W76-Y88 (右)。灰色の線は瞬間距離 (2 ps ごと) を表し、赤色の線は時間を表します。平均 (1 ns ごと)。 代表的な拡張型 (E) およびコンパクト (C) 配座異性体が、付録に表示するために抽出された時刻。 図１０に示す。 (b) (a) の距離の分布をヒストグラム (赤い線) で示した図。 分布は、W60-Y88 (中央) および W76-Y88 (右) の 2 つの異なる状態の存在を示し、コンパクト (C) および拡張 (E) 立体構造を示します (補足図 10 を参照)。 （ c 、 d ）それぞれ代表的な拡張型（ c ）およびコンパクトな（ d ）立体構造。フラグメントヒットとの相互作用に関与する p27-D2 の残基の相対位置を示します。

折りたたまれたタンパク質に対する創薬には、小分子または高分子リガンドとの相互作用に天然に利用される部位に結合する化合物の同定が含まれることがよくあります。 これらのタイプの結合部位は時間的に安定しており、化学的に相補的な小分子との特異的かつ緊密な相互作用を可能にします。 対照的に、無秩序なタンパク質（または無秩序なタンパク質領域）は、同様の一時的に安定した小分子結合部位を示さない、動的で不均一な立体構造を示します。 しかし、時間的に安定な特徴がないにもかかわらず、多くの乱れたタンパク質/領域は、結合時の折り畳みプロセスを通じて高分子パートナーと相互作用します。 我々は、無秩序なタンパク質が他のタンパク質に結合する能力は、小分子に結合する能力も与えるだろうと仮説を立て、本明細書に記載のp27の研究を通じてこの考えを検証した。

p27 タンパク質全体は無秩序であり、その N 末端ドメイン (p27-KID) は Cdk2/サイクリン A に結合すると秩序化されます。p27-KID の D1 サブドメイン内の短い線状モチーフ (配列 R30NLFG34、L、ロイシン)サブドメイン D1 と D2 を連結するサブドメイン LH は、サイクリン A と Cdk2 の表面に接触しますが、結合エネルギーにはほとんど寄与しません 43。 p27のサブドメインD2(p27-D2;長さ34アミノ酸)は広範な二次構造を採用し、結合時にCdk2と広範な疎水性相互作用を形成する(補足図11a、cおよびd)。 さらに、D2 サブドメイン内の残基と Cdk2 の間に多数の水素結合が形成されます。 p27-D2 は 11 個の疎水性および芳香族残基 (I、L、V、F、W、および Y 残基を含む) を示し、その多くは Cdk2 との相互作用に寄与していますが、このサブドメインは独立して安定な疎水性コアを形成しません。

非結合状態では広範な無秩序にもかかわらず、我々は、p27内の2つの重複領域に対して低い親和性にもかかわらず、絶妙な特異性で結合する2つの小分子グループを同定した。 これらの分子は芳香環を含む領域に結合し、W および Y 残基が優先されます。 グループ 1 の分子は局在領域 F87YY89 に結合しましたが、グループ 2 の分子はこの領域および 2 つの W 残基を含む他の 2 つの分子 (W60 および W76) に結合しました。 驚くべきことに、グループ 1 (25 分子) とグループ 2 (14 分子) 内の分子はそれぞれ化学的に類似しており、これら 2 つのタイプの小分子、つまりタンパク質相互作用の化学構造結合活性関係が実証されました。 それぞれの相互作用ポテンシャルマップの「ファジー」特性により、この現象を「ファジー構造活性関係（SAR）」と呼びます（図3a、b）。

ｐ２７結合分子のこれらの化学的特徴は、ｐ２７−Ｄ２内のＮＭＲで同定された結合部位内および隣接する残基の特徴に基づいて合理化することができる。 グループ1とグループ2の分子は2つまたは3つの複素芳香環を示し、これらの環が疎水性相互作用に関与する可能性を示しました（図3a、b;金の多角形）。 両方のグループの分子は、陽性部分に結合する可能性も示しました（図3a、b;シアンの多角形）。これは、グループ1/2結合部位のF87YY89領域がC末端でR90PPR93およびW60に隣接していることと一致しています。グループ 2 結合部位は、N 末端で R58K59 に隣接しています。 グループ 2 結合部位内の残基 W76 は、電気陰性部分と電気陽性の両方、および極性の特徴を持つアミノ酸 (E71GKYEW76QEVEK81) に隣接していますが、電気陰性部分との相互作用の可能性は弱くしか示されていませんでした (図 3b; 赤い多角形)。 静電的な特徴に加えて、水素結合ドナーとアクセプターを示す小分子は、Myc44 に結合する小分子で観察されるように、p27-D2 内の相補的基との一時的な水素結合を通じて特異性を達成する可能性があります。 我々は、p27-D2 ポリペプチド鎖のこれらおよびその他の現在評価されていない特徴が、グループ 1 および 2 の小分子に特異的に結合する可能性を生み出すと主張します。

p27内の小分子結合部位の構造的特徴は何ですか? p27-D2を用いたMD計算により、グループ2結合部位内の芳香族残基（特にW60、W76、Y88）間のペアごとの距離の動的な変動が明らかになりました（図9）。 W60 と W76 は比較的狭い距離範囲 (16.5 ± 2.3 Å) でサンプリングしましたが、W60 と Y88 の間、および W76 と Y88 の間の距離は広い範囲で変動しました (それぞれ 20.5 ± 5.5 Å と 19.6 ± 4 Å)。 さらに、これらの後者の残基対の距離はそれぞれ、コンパクト（C）および拡張（E;図9b、中央および右のパネル）と呼ぶ2つの別個の集団を示しました。 我々は、NMR CSPパターンと一致して、コンパクトな立体構造がグループ2の化合物の結合部位を作成すると提案します（図7c）。 さらに、我々は、拡張された立体構造がグループ1化合物のF87YY89領域への結合に有利であることを提案し、これもNMR CSPパターンと一致しています（図7b）。 W60 には F62 と F64 が隣接し、W76 には Y74 が隣接していますが、突然変異誘発の結果 (補足図 5a ～ f) は、W 残基がグループ 2 の化合物結合の主要な決定因子であることを示唆しています。 これはおそらく、W 残基と Y 残基の側鎖 (F 残基ではない) が疎水性相互作用や π スタッキング相互作用に関与することに加えて、小分子と水素結合を形成する可能性があるためと考えられます。 興味深いことに、距離相関分析(補足図10c)は、コンパクト構造では、Y88がW60またはW76のいずれかに最も頻繁に近いが、両方のW残基に近づくことはまれであることを示した。 これは、Y88 と 2 つの W 残基の一方または他方が近接していることにより、p27-D2 内にグループ 2 化合物の結合部位が形成されたことを示唆しています。 この観察は、個々の W 残基ではなく、両方の W 残基の変異がグループ 2 化合物への結合を無効にすることを示した突然変異誘発の結果とも一致しています (補足図 5c、f 対 a、b、d、e)。 要約すると、p27-D2 は W60 または W76 と Y88 の間で一時的な密接な接触を示し、これによりグループ 2 の化合物の結合部位が形成されると我々は提案しています。 さらに、W 残基と Y88 のどちらも近くない場合、F87YY89 領域内の 3 つの芳香族残基の空間的近接により、グループ 1 の化合物の結合部位が形成されます。 興味深いのは、p27-KID34 の Cdk2/サイクリン A 結合構造において、サブ領域 D2.1 および D2.2 (グループ 2 の化合物に結合する) 内の 5 つの芳香族残基が近接している (ただし、互いに離れている) ことです。 F87YY89領域;補足図11a、cおよびd)。 MD の結果は、Cdk2/サイクリン A が存在しない場合、これら 8 つの芳香族残基のサブセットが一時的に相互作用し、異なる種類の複素環式芳香族小分子 (グループ 1 または 2) の結合部位を作成する場合があることを示しています。

化合物 SJ403 は、p27-D2 を Cdk2/サイクリン A から隔離し、Cdk2 触媒活性を活性化し、p27 の細胞周期阻害機能を阻害するという我々の目標を効果的に達成することが実証されました。 グループ 1 および 2 分子の親和性は低いですが、p27 の特定の領域に対して高い特異性を示します。 上で論じたように、これらの領域内の残基は、そうでない場合には Cdk2 と結合します。 注目すべきことに、スクリーニングされた>2,300の化合物はp27の他の領域(サブドメインD1およびLH)に結合できなかった。これは、これらの他の領域には、小さな複素環を特異的に認識するのに十分な密度の芳香族残基(特にWおよびY残基)が欠けていることを示唆している。芳香分子。 サブドメイン LH は、単独では Cdk2/サイクリン A に結合しませんが、サブドメイン D1 は高い親和性 (Kd、42 nM) でサイクリン A に結合します 45。 この後者の領域内の RxLFG モチーフは、長さが限られているため、はるかに長い D2 サブドメインでは可能であるが、小分子の結合ポケットを作成する立体構造をとることができないと我々は推測しています。 しかし、p27に対するグループ1およびグループ2の化合物の親和性が低いため、細胞、そして最終的にはヒトにおけるp27機能を調節するという我々のより広範な目標に向けたそれらの適用可能性は制限される。 p27に対する小分子の親和性はどのようにして高めることができるのでしょうか? 我々は、グループ 1 および 2 の分子が p27-D2 内である程度の立体構造制限を引き起こし、この制限を強化する分子がより高い親和性を示すことを提案します。 私たちは、化学的に多様で複雑な特徴を示す、より大きな「三次元性」を備えた小分子が、p27を結合して隔離するためのより優れた鋳型となるだろうと予想しています。 合成化学を使用してフラグメント ヒットを最適化するための 2 つの戦略に基づく取り組みが進行中です。 まず、複素環系のさまざまな位置に多様な化学部分を導入してグループ 1 および 2 の足場を「成長」させ、p27-D2 内の W60、W76、および Y88 付近の残基との追加の相互作用を可能にします。 第二に、増殖実験が完了したら、最適なグループ 1 分子とグループ 2 分子を合成的に「リンク」して、p27-D2 への結合をさらに強化します。 これらの将来の実験の結果は、構造に基づく創薬から生まれた化合物最適化のための合成戦略が無秩序なタンパク質に適用できるかどうかを示すでしょう。 結論として、我々は、p27への特異的結合とその阻害を媒介する「ファジーSAR」を有する小分子を発見し、将来的に無秩序なタンパク質標的を合理的に「薬物」化できる可能性を実証した。

確立された手順を使用して pET28a (Novagen) にサブクローニングした後、p27 構築物を N 末端 6xHis アフィニティー タグとともに大腸菌で発現させました 20。 これには、p27-KID (ヒト p27 の残基 22 ～ 105) および次の変異体: W60A、W60F、W76A、W76F、W60A ～ W76A、W60F ～ W76F、F87A、Y88A、Y89A および R90A が含まれます。 p27-D2 (ヒト p27 の残基 58-105) および変異体 C99S-R93C も同様に発現されました。 同位体標識タンパク質 (15N、13C/15N、および 2H/13C/15N) は、確立された手順を使用して MOPS ベースの最小培地で発現されました 22。 すべての p27 コンストラクトをニッケル アフィニティー クロマトグラフィーで精製し、トロンビンで消化して 6xHis タグを除去し、C4 カラム (Vydac) および 0.1% トリフルオロ酢酸含有水/アセトニトリル溶媒を使用する逆相高速液体クロマトグラフィー (HPLC) を使用してさらに精製しました。システム。 タンパク質濃度は、p27-KID、p27-KID-F87A、p27-KID-R90A、p27-D2、およびp27-D2-C99S-のモル吸光係数15,470 M-1 cm-1を使用して、280 nmでのUV吸光度によって決定しました。 R93C; p27-KID-Y88A および p27-KID-Y89A では 13980 M−1cm−1。 単一のトリプトファン残基を持つ p27-KID 変異体では 9,970 M-1 cm-1。 トリプトファン残基を持たないp27-KID変異体では4,470 M-1 cm-1。 全長ヒト Cdk2、活性型 Cdk2 (スレオニン 160 でリン酸化)、短縮型ヒト サイクリン A (残基 173 ～ 432)、および p21-KID を、確立されたプロトコールを使用して発現および精製しました 20,46。

Cdk2/サイクリン A 複合体は、Cdk2 とサイクリン A (モル比 1:1) を 4 °C で 1 時間平衡化した後、20 を含む緩衝液中でサイズ排除クロマトグラフィー (S75 樹脂、GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して精製することによって調製しました。 mM トリス、pH 7.5、200 mM NaCl、5 mM TCEP)。 三元複合体は、2H/13C/15N-p27-D2 を Cdk2/サイクリン A (モル比 1.1:1) で 4 °C で一晩平衡化し、続いてサイズ排除クロマトグラフィー (S200 樹脂、GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ) を使用して精製することによって調製しました。 ）Cdk2/サイクリンA複合体と同じバッファーに入れます。 NMR実験のために、2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/サイクリンA複合体を20mMリン酸Na、pH6.5、200mM NaCl、10mM DTT-D10および10% 2H2Oに緩衝液交換した。

p27-KID への結合をスクリーニングするために使用したフラグメント ライブラリは、異なる基準に従って設計された 2 つのコレクションで構成されていました：（a）1,100 個のフラグメントは Maybridge Ro3 Diversity Fragment Library（「Maybridge」）47 から購入し、（b）1,222 個のフラグメントを購入しました。フラグメントは、社内アルゴリズム (「In-House」) を使用して、エナミン (N = 250) およびライフ ケミカルズ (N = 972) から購入されました。

Maybridge フラグメント コレクションは、フラグメントベースの創薬に化学領域を幅広くカバーするように設計されました。 各フラグメントは、Congreve の 3 つの規則 40 を満たしています。(a) 分子量 < 300。 (b) 水素結合供与体の数 ≤ 3; (c) 水素結合アクセプターの数 ≤ 3; (d) clogP ≤ 3。すべての化合物は実験的に決定された平衡溶解度 ≥200 mM (DMSO) および ≥1 mM (PBS) であり、純度 ≥95% (液体クロマトグラフィー/質量分析による分析に基づく) が確認されており、反応性物質は含まれていません。または有毒な官能基。 1,100 のフラグメントは、コレクション全体 (1,823 フラグメント) の化学的多様性を網羅する「コア」セットを構成します。

社内フラグメント コレクションは、別個の St. Jude ハイスループット スクリーニング ライブラリ (HTS ライブラリ、HTS ライブラリ、 >500,000 化合物; 以下を参照)。 まず、市販のフラグメント コレクション (「フラグメントのような」特性についてフィルタリングされた、より大きな多様性コレクションのサブセット) をフィルタリングして、無機原子、同位体、または無効な構造を含む分子を除去し、十分な量で利用できない分子 (<50 mg) を除去しました。 。 通過する分子は、Pipeline Pilot を使用して Murcko 足場に抽出されました (アルファ原子が保存された Accelrys v. 8.5 の「Generate Fragments」コンポーネント、一般的な方法については参考文献 48 を参照)。 これらの足場は、次のルールに従ってさらにフィルタリングされました: 反応性部分構造の数 = 0 (「REOS」フィルター 49、50、51、回転可能な結合の数 <= 3、重原子の数 >= 10、環の数 >= 1、および単環系の環置換数 >1、および足場を含む St. Jude HTS ライブラリーに存在する分子の数 >= 8。これらの足場を含む分子は市販のフラグメント ライブラリーで同定され、最も高い Oprea の複雑さに従って購入の優先順位が付けられました52。このライブラリには次の平均計算物理化学的特性があります: MW = 246 ± 39 Da、原子数 = 17 ± 3、log P = 1.7 ± 1.0、極性表面積 = 63 ± 19 Å2、水素結合アクセプターの数 = 4.3 ± 1.4 および水素結合供与体の数 = 1.3 ± 0.9. 2 つのフラグメント ライブラリーのこれらおよびその他の化学的特徴の分布は、補足図 12a にまとめられています。

グループ 1 および 2 分子のコンセンサス フィールド マップは、Forge の FieldTemplater モジュールを使用して定義されました (v10、Cresset、REF= http://www.cresset-group.com/products/forge/accessedDec2014)。 FieldTemplater モジュールは、入力として参照分子のセット (最初の 2 ラウンドのスクリーニングで特定されたグループ 1 および 2 の活性化合物、補足表 1A、B) を受け取り、それらの相互作用フィールド間の重複を最大化するためにそれらを整列させようとします。 。 基準分子はまずフィールドポイントを使用して整列され、次に完全な相互作用フィールドを使用して、よりゆっくりとより正確に整列が最適化されます。 アライメントの前に、Forge の「非常に正確で遅い」コンフォメーション ハント オプションとデフォルト設定を使用してコンフォメーションが生成されました。 次のスクリーニングラウンドでモデルを使用して取得された分子のトポロジー的多様性を最大化するために、アライメントで使用される類似性スコアリング関数は、フィールド類似性 100%、形状類似性 0% に基づいていました。

Forge の FIeldScreen モジュールを使用して、グループ 1 およびグループ 2 の分子のコンセンサス フィールド マップを使用して、ChemDiv (www.chemdiv.com) の 10,455 個のフラグメント様分子のデータベースをクエリしました。 フィールド類似性スコアが最も高い 215 個の分子のうち、184 個の化合物が購入されました。 しかし、これらのうち 106 個は、我々のアッセイ条件下では溶解性が低く、スクリーニングされませんでした。 残りの 78 個の化合物から、2D 1H-15N HSQC NMR を使用してさらに 12 個のヒットが特定されました (以下を参照)。

スクリーニングと検証 NMR 実験は、三重共鳴 (HCN) 室温勾配プローブを備えた Varian Inova 600 MHz 分光計、または TCI 極低温勾配プローブとSampleJet サンプルチェンジャー。 フラグメント分子は、最初に DMSO-D6 にそれぞれ 10 mM で溶解した 5 つの分子のプールとして分析されました。 96 ウェル プレートに含まれるフラグメント プールを、Gilson 215 リキッド ハンドラーを使用して緩衝液 (20 mM リン酸 Na、pH 6.5、20 mM NaCl、10% 2H2O、5 mM DTT-D10) または p27-KID タンパク質を含む緩衝液と混合しました。 （１０μＭ ｐ２７－ＫＩＤ）を加えて、最終化合物濃度をそれぞれ２００μＭとした。 最初のフラグメント スクリーニング実験では、タンパク質を含まない化合物プールとタンパク質を含む化合物プールについて、一次元 (1D) 1H- および WaterLOGSY35 NMR スペクトルを記録しました。 ヒットを示したプールは、1D 1H を使用して純粋な化合物を分析することによってデコンボリューションされ、Bruker Avance 600 MHz 分光計を使用した二次元 (2D) 異種核 NMR 実験 (2D 1H-15N HSQC 滴定) によって検証されました。 2D 1H-15N HSQC 滴定に使用した NMR サンプルには、20 mM リン酸ナトリウム、pH 6.5、200 mM NaCl、10% 2H2O 中に 100 μM 15N 標識 p27 タンパク質 (p27-KID、p27-KID 変異体、または p27-D2) が含まれていました。 5mM DTT-D10; DMSO-D6に溶解した化合物を所望の濃度まで滴定しました。 DMSO-D6を添加して一定濃度(2% vol/vol)を維持した。 1H 次元と 15N 次元でそれぞれ 3.5 Hz と 5.7 Hz のスペクトル分解能が達成されました。 トリプトファンとチロシンをそれぞれ、15N-p27-KID (100 μM) に最大 3 mM まで滴定しました。 p27 構築物の共鳴帰属を確立するための三次元 (3D) バックボーン三重共鳴実験は、Bruker Avance 600 MHz 分光計を使用して実行されました。 p27-KID および p27-D2 の割り当ては、付録に示されています。 それぞれ図12b、cおよびd、e。 2H/13C/15N-p27-D2/Cdk2/サイクリン A および SJ403 を使用した 2D 1H-15N TROSY-HSQC NMR 実験は 308 K (35 °C) で記録されました。 15N-p21-KID (20μM)を用いた代表的なフラグメントヒット(それぞれ1mMのSJ319843、グループ1およびSJ403、グループ2)の2D 1H-15N HSQC実験を、Bruker Avance 600 MHz分光計を使用して298 Kで記録した。 NMR スペクトルは Bruker Topspin ソフトウェアを使用して処理し、コンピューター支援共鳴割り当て (CARA) ソフトウェアを使用して分析しました53。

化学シフトの摂動は通常、1H と 15N の化学シフト値を組み合わせたものとして定量化されます。 しかし、p27 に結合する小分子の一次データの分析では、最大の CSP は 1H 次元のものであり、統計的に有意であり、対応する 15N CSP 値は多くの場合小さく、有意ではないことが示されました。 したがって、組み合わせた化学シフト値を使用すると、化合物の結合の影響がマスクされます。 また、HSQC スペクトルの 1H および 15N 次元の実験的デジタル分解能と、平均 CSP 値に平均値の標準偏差の 2 倍を加えたもの (Δδave + 2σ) として定義される閾値に対する CSP の大きさを厳密に考慮しました。 したがって、統計的有意性の評価は、特定の CSP 値が、i) 所定の次元 (1H または 15N) での実験スペクトル分解能、および ii) その次元の量 Δδave + 2σ より大きいかどうかに基づいていました。

グループ 1 およびグループ 2 (それぞれ SJ572710 および SJ572403) からの代表的なフラグメント ヒットの 15N-p27-KID (100 μM) への 16 ポイントの滴定を、15N 中にプロトン デカップリングを備えた採用された「インフェーズ」2D 1H-15N HISQC を使用して記録しました。化学シフト標識は、振幅 7.1 kHz の WALTZ16 複合パルスで達成されます54,55。 すべての実験は、TCI 極低温勾配プローブを備えた Bruker Avance 800 MHz 分光計で収集されました。 15N-p27-KID (100 μM) と阻害剤の次のモル比を使用しました: 1:0、1:0.1、1:1.5、1:3、1:4.5、1:6、1:7.5、1:9 、1:10.5、1:12、1:15、1:18、1:21、1:24、1:27、1:30。 各スペクトルは、15N 次元と 1H 次元でそれぞれ 256 (t1,max = 31.0 ms) と 1024 (t2,max = 106.5 ms) の複素点で記録され、各点で 8 つの過渡現象が収集されました。 1H および 15N 次元のスペクトル分解能は、それぞれ 2.4 Hz および 1.7 Hz でした。 さらなる分析を考慮するには、滴定全体にわたる化学シフトの摂動がこの分解能の閾値より大きくなければなりませんでした。 データは、NMRPipe パッケージ 56 を使用して処理され、Scipy コンピューティング ライブラリと Mathematica (Wolfram Research) を使用して Python で記述された社内スクリプトを使用して分析されました。 ピーク位置決定における人間のバイアスを軽減するために、NMRpipe の自動ピーク選択機能が利用され、特定の化学シフトに対する滴定の軌跡全体にわたって各共鳴にスペクトル ウィンドウが割り当てられました。 特定の共鳴のピーク位置の誤差は、15N または 1HN の線幅を信号対雑音比で割ったものとみなされました。 スペクトル分解能およびΔδave + 2σ を超える化学シフト摂動を示したすべての共鳴は、その後グループ化され、それぞれの最大化学シフト差および全体的な解離定数 (Kd) について全体的に適合されました。 Kd 値の誤差は、リガンド濃度に 10% の誤差を課し、化学シフトのピーク位置の誤差を考慮したモンテカルロ法を使用して決定されました。

p27-D2-C99S-R93C変異体を、メーカーのプロトコールに従って、20mMリン酸Na、pH7.3、20mM NaClを含む緩衝液中でAlexa Fluor488-C5-マレイミド(Life Technologies、p27-D2-FL)と結合させた。 結合タンパク質を、Ｃ４カラム（Ｖｙｄａｃ）および０．１％トリフルオロ酢酸含有水／アセトニトリル溶媒系を使用する逆相高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）によってさらに精製した。 凍結乾燥したＨＰＬＣ画分を、２０ｍＭリン酸Ｎａ、ｐＨ７、２００ｍＭ ＮａＣｌ、３．５ｍＭ ＴＣＥＰを含有する緩衝液中に再懸濁した。 蛍光異方性測定は、Horiba Fluorolog 3 分光蛍光計を使用して 25 °C で実行されました。 簡単に説明すると、p27-D2-FL (20 nM) を Cdk2/サイクリン A (300 nM) と混合し、必要量の凍結乾燥化合物 (SJ403) に加えました。 蛍光測定前に、すべてのサンプルを暗所で 4 °C で一晩インキュベートしました。 蛍光異方性結合データは、KaleidaGraph を使用して分析されました。 カーブフィッティングは、非線形回帰結合モデルによる 3 つの独立した実験の平均に対して実行されました。

Cdk2/サイクリン A (200 pM) をヒストン H1 (15 μM; EMD Millipore)、p27-D2 (200 nM) およびさまざまな量の凍結乾燥 SJ403 と混合し、4 °C で一晩インキュベートしました。 Cdk2活性に対するSJ403化合物の効果は、p27-D2の非存在下で同様の実験を行うことによって決定された。 続いて、ATP（総濃度50μM、そのうち6μCiのγ 32P-ATP（PerkinElmer, Inc））を各反応液に添加し、さらに30℃で35分間インキュベートした。 各反応の総量は 20 μL でした。 サンプルバッファーには、20 mM HEPES pH 7.3、25 mM β-グリセロールリン酸ナトリウム、15 mM MgCl2、16 mM EGTA、0.5 mM Na3VO4 および 10 mM DTT が含まれていました。 反応をSDS-ゲルローディングバッファー(5μL)の添加によりクエンチし、その後SDS-PAGE(10μL)により分析した。 ゲルを真空下70℃で乾燥し、ホスホイメージャー（GE Healthcare、ニュージャージー州ピスカタウェイ）を使用して32P-ヒストンH1バンドを定量しました。 ＩＣ５０値は、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを使用した曲線当てはめによって決定した。 実験は３回行い、平均ＩＣ５０および平均値の標準偏差を報告する。

グラフィックス プロセッシング ユニット (GPU) に最適化された AMBER 12 ソフトウェア 57 を使用した全原子 MD シミュレーションを使用して、p27-D2 ドメインの立体構造の状況を調査しました。 p27-KID/Cdk2/サイクリン A 構造 (PDB ID、1JSU) 内の p27-D2 の立体構造を、pH 7.0 を反映するように修正されたアミノ酸のプロトン化状態を使用した MD 計算からの出発構造として使用しました。 この構造を、p27-D2 分子よりもすべての面で 15 Å 大きい TIP3P 水の長方形の箱の中に置きました。 対イオンを追加してシステムを中和することに加えて、シミュレーションでの実験条件を模倣するために 20 mM NaCl を追加しました。

前述のように、システムは 298 K での複数段階のエネルギー最小化を使用して平衡化および安定化されました 58。 すべての生産実行は、周期境界条件を備えた一定数の粒子、体積、エネルギー (NVE) アンサンブルを使用して実行されました。 静電相互作用には粒子メッシュ Ewald (PME) 法が使用され、レナード・ジョーンズ相互作用には 10 Å カットオフが使用されました。 SHAKE アルゴリズムは、共有結合したすべての水素原子の動きを制限するために使用されました。 シミュレーションは 298 K、1 atm の圧力で実行されました。 シミュレーションの合計時間スケールは 0.4 マイクロ秒で、スナップショットは 2 ps ごとに保存され、その結果、軌道から合計 200,000 のスナップショットが作成されました。

この記事を引用する方法: Iconaru, LI et al. 無秩序なタンパク質、p27Kip1を阻害する小分子の発見。 科学。 議員第5号、15686; 土井: 10.1038/srep15686 (2015)。

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著者らは、NMR実験の支援についてはChristy R. Grace、化合物ライブラリ管理についてはHeather Ross、原稿に関するコメントについてはAriele Viacava Follisに感謝する。 この研究は、米国国立衛生研究所 (NIH) 助成金 R01CA082491 および 1R01GM083159 (RWK へ)、2R01DC006471 および 1R21DC013879-01 (JZ へ)、海軍研究助成局 N000140911014、N000141210191 および N0001 によって支援されました。 41210775 (JZ 宛)、米国国民がん研究所がんセンター支援助成金 P30CA21765 (セント ジュード小児研究病院) および ALSAC。 LII は、セント ジュード小児研究病院からガーウッド財団フェローシップを受賞しました。 DB は、米国国立一般医科学研究所 (F32GM113290) からの支援に感謝いたします。

カビサ・バラサム

現在の住所: Center for Chemical Biology and Therapeutics, Institute for Stem Cell Biology and Regenerative Medicine, GKVK, Bellary Road, Bangalore, 560065, India

構造生物学部、メンフィス、テネシー州、38105

ルイージ・I・イコナル、デヴィッド・バン、ウェイシン・チャン、リチャード・W・クリワッキ

発生神経生物学部、メンフィス、テネシー州、38105

ルイージ・I・イコナル＆ジャン・ズオ

ケミカル生物学および治療科、セントジュード小児研究病院、メンフィス、テネシー州、38105

カビタ・バラサム & アナン・A・シェラット

計算科学および工学部門、ヘルス データ サイエンス研究所、オーク リッジ国立研究所、オーク リッジ、テネシー州、37830

アルビンド・ラマナサン

微生物学、免疫学、生化学学部、テネシー大学健康科学センター、メンフィス、テネシー州、38163

リチャード・W・クリワッキ

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LII、DB、AR、WZ、AS、JZ、および RWK が設計した研究。 LII、DB、KB、AR は実験を実施しました。 LII、DB、KB、AR、AS、RWK の分析データ。 そしてLII、DB、AR、AS、JZ、RWKが原稿を書きました。

著者らは、競合する経済的利害関係を宣言していません。

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転載と許可

Iconaru、L.、Ban、D.、Bharatham、K. 他。 無秩序なタンパク質、p27Kip1を阻害する小分子の発見。 Sci Rep 5、15686 (2015)。 https://doi.org/10.1038/srep15686

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受信日: 2015 年 7 月 14 日

受理日: 2015 年 9 月 25 日

公開日: 2015 年 10 月 28 日

DOI: https://doi.org/10.1038/srep15686

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